Base racional de una propuesta de estudio sobre mutaciones en el gen de Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DPD) en pacientes oncológicos expuestos a 5 - Fluoro - Uracilo

Dr. Matías Valsecchi


Introducción

        Durante los últimos años la medicina ha experimentado un cambio de paradigma en el cual la biología molecular ha tomado cada vez más relevancia en las decisiones medicas a tal punto que en un futuro cercano es probable que la misma forme una parte importante de la ciencias biomédicas, ya sea colaborando en los diagnósticos u orientando en la terapéutica de los pacientes. La razón de esto último es clara, cuanto más se avanza en el conocimiento de los procesos moleculares que determinan las características fisiopatológicas de la enfermedad, más se pueden predecir las respuestas que los individuos presentarán frente a una o otra circunstancia. El objetivo último es poder dejar el concepto poblacional al cual nos hemos acostumbrado, e intentar abocarnos cada vez más al concepto de lo individual. Un par de años atrás estas ideas se mantenían en la esfera de lo imposible, pero durante la última década, claramente impulsado por la secuenciación total del genoma humano, cada vez es más posible ver ya no a cada patología sino a cada individuo como un ser independiente, que no necesariamente responde según las estadísticas y cuyo patrón de respuesta al agente nocivo o al tratamiento empleado puede ser previsto con un grado de certeza mucho mayor que el estándar actual. Resultado de este cambio es el surgimiento de disciplinas como la farmacogenética la cual intenta predecir basándose en estudios sistemáticos de los genomas de los pacientes, cuales serán los efectos que determinados fármacos tendrán en el organismo y por qué se producen la variaciones en los perfiles farmacocinéticos, farmacodinámicos y de toxicidad. A simple vista es claro que para el medico tratante resulta más que tentador poder tener una manera de predecir que paciente tendrá toxicidad severa a una droga o en quienes será necesario reducir las dosis de un fármaco a fin de evitar males mayores. En pocas palabras si estos métodos estuvieran disponibles, no emplearlos sería lo mismo que utilizar cualquier antibiótico sin solicitar previamente un antibiograma, práctica que en la actualidad pocos se animarían a discutir. El estudio del gen de dihidropirimidina deshidrogenasa es un ejemplo de la aplicación que la farmacogenómica ha encontrado en la medicina actual y probablemente constituya tan solo la punta visible de un iceberg que cada vez está saliendo más hacia la superficie.


Fundamentos del Estudio

        La variabilidad interindividual de los seres humanos tiene muchos fundamentos teóricos. Uno de ellos es la incapacidad de la ADN polimerasa de replicar el genoma en forma completamente exacta pese a los múltiples mecanismos que la evolución se ha encargado de desarrollar. Se calcula que la tasa de mutaciones en humanos es de 1 cada 1000 nucleótidos, lo cual significa que cada humano difiere aproximadamente en 0.1% de su genoma. Esta cifra que parece insignificante no lo es para nada, e incluso pese a que la mayoría de ellas son aparentemente silentes este concepto se encuentra actualmente en revisión. Resultado de lo anterior cada unidad funcional del genoma, llamado gen, posee diferentes variantes las cuales se denominan alelos. Cada ser humano posee uno o dos de ellos y la mayoría (existen notorias excepciones que no vienen al caso) se heredan cada uno de cada progenitor. Para diferentes genes existen descriptos diferentes cantidades de alelos. Todos ellos determinan nuestras características fenotípicas, muchas de las cuales son muy obvias como son el color de los ojos, la contextura y la altura de cada uno. Ahora bien el metabolismo de las drogas también se encuentra regido por estas diferencias geonómicas, y eso explica por ejemplo las variabilidades en las concentraciones y la vida media que alcanzan las drogas en la sangre de los pacientes, algunas de las cuales tienen bajo índice terapéutico y pequeñas diferencias traen grandes consecuencias. Ejemplo clásico de esto último son las drogas de quimioterapia usadas en patologías oncológicas.
        El 5-Fluoro-Uracilo (5-FU) es una prodroga que debe activarse intracelularmente a 5 - Fluoro - 2 - deoxiuridina - monofosfato para ejercer su principal mecanismo que es la inhibición de la enzima timidilato sintetasa y así reducir la síntesis de novo de bases pirimidínicas. Desde el punto de vista farmacocinético, el 85 % de la droga se cataboliza por una enzima llamada dihidropirimidina deshidrogenasa o DPD a metabolitos inactivos (especialmente beta-Alanina Fluorada), por lo cual esta enzima, que se expresa en muchos tejidos pero especialmente en el hígado, cobra un rol fundamental en cuanto a lo que se refiere a dosis máximas alcanzadas, efectividad antineoplásica y toxicidad.
        El uso en la práctica oncológica diaria de este antimetabolito mostró que algunos pacientes presentaban una toxicidad desmedida que incluía leucopenia grado IV (clasificación de la WHO), mucositis y toxicidad cerebelosa, siendo la mielosupresión el efecto más frecuente. La base bioquímica de dicha toxicidad comenzó a ser comprendida en el año 1985 cuando se publicó el primer caso de toxicidad severa a 5-FU en un paciente que tenía hiperpirimidinuria familiar (1). El déficit total de la enzima DPD constituye una rara entidad autosómica recesiva que se manifiesta en la primera infancia y se caracteriza por déficit neurológico, retardo mental, convulsiones e hiperuraciluria. La descripción de un segundo caso de toxicidad severa al 5-FU en pacientes con deficiencia familiar de DPD en el año 1988 desterró las dudas sobre la clara asociación existente entre baja actividad de la enzima DPD y la toxicidad severa al 5-FU.(2) En el año 1991 esto fue concebido por primera vez como un síndrome farmacogenético. Ahora bien, los pacientes que expresan la enzima pero con valores inferiores a los normales son fenotípicamente normales pero el déficit se manifiesta al exponerlos a la droga 5-FU. Un estudio poblacional prospectivo publicado en el año 1994,(3) planeado para calcular la incidencia del déficit parcial o total de la actividad de la enzima DPD en leucocitos de pacientes con cáncer, reclutó 185 pacientes franceses y mostró una distribución unimodal tipo gaussiana con una media y una mediana de la actividad enzimática calculada en 0.222 nmol/mg/ min, lo cual significa que el 95% de la población se encuentra entre los dos desvíos estándares, y el 2.5-3% de la población está por debajo del valor normal. En el trabajo la variabilidad interindividual (del 95% de la población normal) de la actividad de la DPD no se correlacionó con toxicidad, sin embargo los autores recomendaron reducir las dosis aplicadas en los pacientes cuyos valores se encuentren por debajo del límite inferior normal (2 DS por debajo la media). Otro estudio en pacientes con cáncer de mama(4), publicado en el año 1998, también dosó actividad enzimática en leucocitos periféricos, y tras reclutar 360 pacientes mostró que el 5,8% de la población estudiada (21 pacientes) presentaban actividad enzimática por debajo del percentilo 95%. Cabe mencionarse que no existen estudios similares en poblaciones de países latinoamericanos.
        El dosaje de la actividad enzimática de la DPD leucocitaria es un método engorroso, caro y que pocos laboratorios lo pueden hacer en forma sistemática. En pocas palabras no es el método ideal para emplear como "tamizaje" en pacientes que van a recibir 5-FU.
        Durante los últimos 20 años el tremendo crecimiento de las técnicas de biología molecular ha hecho que muchos laboratorios vuelquen sus esfuerzos en perfeccionar y sistematizar dichas técnicas a tal punto que actualmente forman parte de la actividad diagnóstica cotidiana. La hemato-oncología es, tal vez, la disciplina emblemática al respecto. Esto último sumado a la necesidad de profundizar los conocimientos fisiopatológicos de la genética humana, ha llevado a que las deficiencias enzimáticas sean estudiadas profundamente. El caso de la DPD no fue una excepción. En el año 1994 el ADNc (complementario) de la enzima DPD humana fue clonado y secuenciado, publicándose luego su completa secuencia y estructura genómica (5,6,7). Desde entonces se ha tratado de entender las bases genéticas de la variabilidad interindividual en la actividad de dicha enzima, a fin de encontrar un método fácil de realizar y que detecte claramente la población en riesgo.
        El gen de la DPD se encuentra en el cromosoma 1 del cariotipo humano región 1p22, posee aproximadamente 150 Kb, son 23 exones, una región promotora y codifica para una proteína de 111 kDa. Su Gene ID es 1806, Locus Tag: HGNC:3012 ; MIM 274270 y su símbolo oficial es DPYD. Para mayor información remitirse a www.ncbi.nlm.nih.gov/EntrezGene o al GeneBank cuyo número de acceso es U09178. En el año 1995, posterior a su secuenciación total, se publica el primer estudio (8) donde se comienza a vislumbrar uno de los mecanismos genéticos que hoy en día algunos consideran el más prevalente. El estudio se baso en el análisis del gen DPYD de un paciente holandés y de sus familiares (pedigree) con déficit total de DPD y concluyó que el ARNm de dicho paciente era incompleto, faltándole 1 exón. Algunos familiares eran heterocigotos para la mutación y mostraban valores de actividad bajos de la DPD pero no ausentes, el paciente era homocigoto. Un año después, otro estudio (9) evidenció que la base de dicho fenómeno llamado "exón skipping" (salteo de un exón) se debía a una mutación puntual en un nucleótido, una guanina pasaba a ser una adenina (GT AT) en una de las regiones más conservadas del genoma que son las regiones consensos para splicing o ensamblaje de los ARN inmaduros. Resultado de esto todo un exón se pierde porque no es reconocido por la maquinaria de ensamblaje. Téngase presente que dicha región está en el intrón y no en el exón. El exón perdido codifica para un dominio activo de la enzima, cuya ausencia elimina totalmente su actividad. Éste trabajo se basó en el estudio de un paciente británico que había experimentado toxicidad grado IV por 5-FU, y también se estudio su pedigree constatándose que muchos familiares eran heterocigotos para la mutación, y ellos tenían valores de actividad de DPD menores al 50% que el presente en la población general. Uniendo estos datos se estimó que la presencia de un alelo mutado para el DPYD era suficiente para generar toxicidad al 5-FU y basándose en estos hallazgos, sumados a los datos poblacionales de la actividad de la enzima DPD citados antes, se calculó que el 3% de la población sajona era heterocigoto para un alelo mutado, infiriéndose la presencia de 1 homocigoto por cada 1000 nacimientos. Estudios sobre presencia de esta mutación en poblados de Finlandia mostraron un estado de heterocigocidad del 4 %, y uno hecho en Taiwán ascendió hasta el 5%. Sin embargo, dichos valores no pudieron ser reproducidos en japoneses ni afroamericanos. No se consta de estudios similares en poblaciones latinoamericanas.
        Desde aquel momento hasta la actualidad se han descrito más de 30 mutaciones en el gen DPYD y la comunidad científica se debate sobre dos grandes cuestiones, la primera es saber cuál de las mutaciones es la más relevante y la segunda es saber cuál es la distribución de dichas mutaciones en las distintas poblaciones. El fin último es validar un test o una prueba de laboratorio que permita detectar a los pacientes factibles de realizar toxicidad letal con el 5-FU. Los datos son contradictorios y es por eso que esta clase de investigación debe ser realizada en cada población en particular.
        Para el año 1998 ya existían 5 mutaciones descritas para el gen que producían déficit de la enzima, una era la anteriormente citada y las otras 4 eran mutaciones puntuales en codones que llevaban a cambios de aminoácidos o terminaciones precoces. En un estudio publicado ese año (10) se analizaron los leucocitos de 226 sujetos caucásicos sanos (escoceses) dosándoseles actividad enzimática de la DPD. Se observó congruentemente con los estudios anteriores una alta variabilidad en sus resultados (46,6% Vs 34% en caucásicos norteamericanos y 33% en franceses de estudios previos) pero también con una distribución gaussiana. Se tomaron los 30 pacientes con menor actividad de la enzima y los 30 con mayor actividad y se analizaron sus genomas. Ninguno de ellos tuvo la mutación descrita previamente en el párrafo anterior (GT AT cuyos otros nombres son: "exon 14 splice site mutation" porque el exón que se pierde es el 14 ó "IVS14+1G A") y sí en cambio aparecieron las otras. Estudios como este comenzaron a hacer dudar de la afirmaciones expresadas en los primeros trabajos que atribuían una relevancia fundamental a la mutación GT AT, a tal punto que un trabajo presentado en el año 2000 (11) , casi destierra los conceptos planteados hasta el momento. En él, sus autores estudiaron las 13 diferentes mutaciones que se conocían en 23 pacientes oncológicos con baja actividad de la enzima y en 14 con actividad normal. Muchas mutaciones no estuvieron presentes, otras como la IVS14+1G A aparecieron en sujetos con actividades enzimática normales, por lo cual los autores concluyeron que las mutaciones conocidas no explicaban la compleja regulación in vivo de la enzima. Como es conocido en la conducta humana toda acción trae una reacción, y es por eso que ese mismo año los que creían que las mutaciones conocidas sí explicaban los déficit de DPD publicaron un trabajo (12) donde se analizaron 37 pacientes con cáncer (colon, recto, mama y gástrico) que habían sufrido toxicidad por 5-FU. De ellos nuevamente se dosó actividad de la enzima y 22 pacientes (59 % de su muestra) presentaban menos del 70% considerado normal. De esos 22 pacientes se analizaron los genes de DPYD en 14 de ellos, de los cuales 11 presentaban mutaciones conocidas, siendo la IVS14+1G A la más frecuente puesto que se encontró en 6 de los 14 pacientes (43%).
        Durante el año 2001 los principales autores de los trabajos a favor de la mutación IVS14+1G A, publicaron dos estudios que reforzaban sus teorías. En el primero de ellos, (13)se describe por primera vez la muerte de un paciente que recibió 5-FU y cuyo análisis del genoma mostró que era homocigoto para la mutación IVS14+1G A. En este artículo se presenta también por primera vez una técnica fácil mediante la cual se puede dosar la presencia de dicha mutación. Los autores emplearon dos primers específicos de los intrones que rodean al exon 14 de manera tal de amplificar dichas regiones. Luego analizaron sus secuencias y confirmaron la presencia de la mutación (la secuencia de primers "foward" y "reverse" se encuentra publicada). Como este método todavía era engorroso, al mismo tiempo se emplearon primers diferentes ("NDE foward y reverse") que son productos modificados que introducen un sitio de restricción de la enzima NdeI de manera tal que si la mutación IVS14+1G A se encuentra presente, la enzima fracciona al producto amplificado en tres fragmentos en vez de los 2 que normalmente deben existir (luego esto se visualiza con la técnicas convencionales de electroforesis en agarosa o poliacrilamida + bromuro de etidio). El método fue llamado "mutagénesis de sitio dirigida mediada por PCR" (PCR-mediated site-directed mutagenesis). Se introdujo así un método barato de tamizar a la población en busca de esta mutación, y con ello, los autores estudiaron a 1357 caucásicos holandeses normales, de los cuales 24 fueron heterocigotos para IVS14+1G A, calculándose una frecuencia de heterocigocidad en la población holandesa de 1,8%. En dicha población la inferencia de homocigotos por el método del equilibrio de Hardy-Weinberg es de 1,2 en 10.000 individuos. De aquí surge la primer recomendación seria de tamizar a los pacientes oncológicos que vayan a realizar quimioterapia para ver si tienen la mutación IVS14+1G A. Un segundo trabajo hecho en alemanes reforzó la recomendación (14). En él se empleo un método basado en PCR de transcriptasa reversa (RT-PCR) para la identificación rutinaria de la mutación IVS14+1G A en 800 pacientes escogidos de hospitales de Alemania (572 ADN extraído de leucocitos, 95 de tejido congelado y 133 de tejido embebido en parafina) estableciéndose una prevalencia poblacional del 1 %. También se estudiaron 25 pacientes con toxicidad al 5-FU, encontrándose la mutación en 6 de ellos (5 heterocigotos y un homocigoto).
        De lo expuesto extensamente hasta aquí, puede concluirse que la presencia de mutaciones ya descritas en el gen de la dihidropirimidina deshidrogenasa están bien establecidas en los países de Europa del Norte y Noreste (Holanda, Alemania, Finlandia, Gran Bretaña) Algo similar pasa en las poblaciones sajonas de EEUU. Sin embargo también es claro que los datos aún son inconcluyentes, a tal punto que estudios similares fracasaron en otras regiones o razas del mundo (Japón, Afroamericanos, etc). Incluso entre los propios europeos del norte todavía existen dudas sobre si hay que rutinariamente emplear esta técnica para detectar a los pacientes susceptibles previo al uso de 5-FU (15), por lo cual y teniendo en cuenta la ausencia total de información sobre siquiera la presencia de esta mutación en nuestra población, encontramos más que justificado realizar un estudio que intentar develar la presencia o ausencia de las mutaciones más frecuentes en nuestra población.




Referencias

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